RMMG - Revista Médica de Minas Gerais

História da Medicina

O laboratório nas doenças sistêmicas auto-imunes da célula le à célula HEp-2: uma jornada de 50 anos revelando auto-anticorpos

The laboratory in the systemic autoimunne diseases from the le cell to HEp-2 lineage: a journey through 50 years of autoantibodies discovery

Raquel Monteiro de Castro Lara¹; Suzane Pretti Figueiredo Neves²

1. Médica Residente de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial do HC-UFMG
2. Professora Adjunta do Departamento de Propedêutica Complementar da Faculdade de Medicina da UFMG. Coordenadora do Setor de Soro-imunologia do Serviço de Medicina Laboratorial do HC-UFMG

Endereço para correspondência

Suzane Pretti Figueiredo Neves
Avenida Alfredo Balena, 190 - 6º andar Bairro Santa Efigênia
Belo Horizonte - MG
E-mail: suzane@medicina.ufmg.br

Data de Submissão: 20/02/04
Data de Aprovação: 02/08/04

Departamento de Propedêutica Complementar da Faculdade de Medicina da UFMG

Resumo

O termo "anticorpos antinucleares" é usado para designar um grupo de auto-anticorpos contra diversos componentes celulares, cuja produção é considerada característica das doenças sistêmicas auto-imunes. Sua detecção tem sido a principal ferramenta de auxílio no diagnóstico de tais afecções. Este artigo apresenta uma revisão histórica sobre a pesquisa de anticorpos antinucleares: a descoberta da célula LE, o método tradicional de FAN por imunofluorescência indireta e o rastreamento de auto-anticorpos por imunoensaio enzimático.

Palavras-chave: Técnicas e procedimentos de laboratório / história; Anticorpos antinucleares; História da Medicina

 

INTRODUÇÃO

O diagnóstico das doenças reumatológicas auto-imunes é considerado complexo devido ao seu pleomorfismo clínico. Assim, desde que estas afecções foram reconhecidas, há necessidade de exames complementares, capazes de ajudar na diferenciação de fenômenos auto-imunes irrelevantes de doenças auto-imunes e, em alguns casos, diferenciar uma doença de outra^1,2.

Os anticorpos antinucleares (ANA) são um grupo diversificado de auto-anticorpos que reagem com componentes celulares, cuja produção aumentada é considerada característica das doenças auto-imunes sistêmicas, incluindo Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), Síndrome de Sjögren (SS), Artrite Reumatóide (AR), Esclerose Sistêmica Progressiva, Polimiosite e Doença Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC)³.

Este artigo revisa a propedêutica laboratorial disponível para detecção dos ANAs, com enfoque na metodologia, indicando as vantagens e limitações de cada técnica e fornecendo informações úteis para uma abordagem mais racional do paciente com suspeita de doenças auto-imunes sistêmicas.

 

A CÉLULA LE

A observação da célula LE (Lupus Erythematousus Cell) por Hargraves, Richmond e Morton⁴, em 1948, deu-se em um exame microscópico de esfregaço de medula óssea de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico, que foi acidentalmente incubada. Estes autores observaram um neutrófilo contendo uma inclusão citoplasmática grande, arredondada, homogênea e levemente acidófila, que deslocava o núcleo do polimorfonuclear para a periferia (Figura 1).

 

 

A partir desta descoberta, a célula LE foi considerada um marcador do LES e a "Pesquisa de Células LE no sangue periférico" foi o primeiro método de detecção de anticorpos antinucleares. O teste, trabalhoso e artesanal, procurava imitar in vitro as circunstâncias em que a célula LE foi vista pela primeira vez. Consistia na adição de pérolas de vidro a um tubo de sangue anticoagulado que era agitado repetidamente, de modo a danificar algumas células, liberando o núcleo e outros fragmentos nucleares. Acreditava-se que, durante a incubação, auto-anticorpos - anti-DNP (desoxiribonucleoproteína) - contidos no soro, opsonizariam núcleos celulares que, posteriormente, seriam fagocitados por leucócitos polimorfonucleares, formando as células LE vistas nos esfregaços corados com Giemsa². Entretanto, apenas 30% dos pacientes lúpicos apresentavam pesquisa de células LE positiva. Ainda assim, por ser o único exame laboratorial disponível e apresentar boa especificidade, a presença destas células no sangue periférico foi incluída entre os critérios do American College of Rheumatology para diagnóstico de LES, em 1982⁵.

Baseado no suposto mecanismo de formação desta célula, por muitos anos prevaleceu o dogma de que autoanticorpos eram reativos apenas no meio extracelular e que as lesões teciduais observadas seriam resultantes da formação de imunocomplexos e posterior ativação do complemento. Mais recentemente, demonstrou-se que os anticorpos antinucleares são capazes de penetrar, reagir e alterar funções de células vivas⁶. O mecanismo básico do fenômeno da célula LE é, na verdade, a fagocitose de restos celulares originados de apoptose induzida pela internalização de anticorpos antinucleares, mais especificamente do antidsDNA, abrindo novas possibilidades para o entendimento dos processos imunopatológicos e novas perspectivas de atuação fisiológica da resposta humoral⁷.

Apesar do grande valor histórico da célula LE e do papel fundamental representado por ela na elucidação da patogenia das doenças auto-imunes, sua procura em sangue periférico é considerada hoje ultrapassada, tendo deixado de figurar entre os critérios diagnósticos de LES, desde 1997⁸. Entretanto, quando encontradas in vivo em derrames cavitários, são pistas diagnósticas valiosas e de grande especificidade.

 

O FAN

Em 1957, com o desenvolvimento de técnicas de imunofluorescência indireta (IFI), surgia o exame conhecido como FAN (fator antinuclear) para identificação de anticorpos antinucleares⁹. Mais sensível e de execução mais fácil que a pesquisa de células LE, em 1982 o FAN passou a fazer parte dos critérios revisados do American College of Rheumatology, como um dos onze critérios diagnósticos de LES⁵.

A técnica consiste na incubação de diluições seriadas do soro do paciente em lâmina contendo células animais como substrato. Estando presentes, os anticorpos reagem com os antígenos celulares, formando um complexo antígeno-anticorpo. Anti-imunoglobulina humana conjugada com fluoresceína é adicionada e, posteriormente, a lâmina é examinada em um microscópio de luz UV. Assim, dependendo do(s) anticorpos(s) existente(s), vários padrões fluorescentes podem ser observados².

O teste utilizava, inicialmente, substratos de células animais: in prints ou cortes histológicos de rim ou fígado de roedores. Atualmente, recomenda-se o uso de células tumorais da linhagem HEp-2, originadas de tumores epiteliais de laringe^10,11,13. Entre as vantagens que estas células oferecem está o fato de que se trata de antígenos humanos e não de animais. Apresenta, ainda, maior sensibilidade devido às suas características neoplásicas, tais como a grande relação núcleo/citoplasma, presença de vários nucléolos e citoplasma rico em fibrilas e organelas. Além disso, as células HEp-2 podem ser visualizadas em todas as fases da divisão celular, aumentando ainda mais o número de antígenos expostos.

Hoje, a pesquisa de auto-anticorpos em células HEp2 é capaz de detectar anticorpos circulantes dirigidos contra os mais variados constituintes celulares: antígenos nucleares, nucleolares, citoplasmáticos e do aparelho mitótico^10-13. Devido à variedade de antígenos detectáveis por este teste, recomenda-se aos laboratórios alterar sua denominação, deixando claras as reais potencialidades do método¹². (Figura 2). Recomenda-se, também, que o laudo do exame contemple todas as possíveis reatividades observadas nos diversos compartimentos celulares, bem como uma breve interpretação dos achados.

 

 

O Uso Clínico do FAN

A principal indicação clínica para a pesquisa do FAN continua sendo no diagnóstico de LES. Praticamente, todos os pacientes com LES têm um FAN positivo quando são utilizadas células HEp-2, o que se traduz em sensibilidade de 93% a 100%. Portanto, um FAN negativo virtualmente afasta a possibilidade da doença. Entretanto, a especificidade do teste é baixa, estimada em 57%, pois o teste pode ser positivo em uma infinidade de situações como infecções viróticas (inclusive por HIV), hanseníase, endocardite bacteriana, hepatites, alergias e neoplasias, principalmente linfoma. Pode ser positivo, também, em pacientes com implantes de silicone e até mesmo em indivíduos sadios^2,14,16. A explicação para a presença de autoanticorpos em tantas condições é que a maioria deles não é específica para doenças auto-imunes e podem ser produzidos como resultado da ativação policlonal de linfócitos B em situações de grande estimulação antigênica^16,17.

Reações falso-negativas podem ocorrer em alguns pacientes com anticorpos anti-SS-A/Ro isolado. Este antígeno está presente em pequenas quantidades na célula HEp-2 intacta e, durante a fixação na lâmina, pode ser perdido, o que pode levar a resultados falso-negativos em até 26% das amostras positivas para este anticorpo, quando pesquisado por técnicas específicas¹⁵. A Tabela 1 mostra valores de sensibilidade e especificidade do FAN nas principais doenças reumatológicas auto-imunes.

 

 

No que diz respeito à utilidade clínica de um teste, é extremamente importante o conhecimento dos valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN). O valor preditivo negativo do FAN para LES é extremamente elevado, ou seja, diante de um FAN negativo, a possibilidade de não haver a doença é de virtualmente 100%. O valor preditivo positivo por sua vez, é bastante baixo, em torno de 11%. Dessa forma, ao analisar um FAN positivo, o clínico deve ter em mente o baixo poder deste teste em indicar a presença desta doença.

Um problema muito expressivo no dia-a-dia do laboratório é a positividade do teste sem que haja correlação clínica. Em soro puro ou em baixas diluições, virtualmente toda a população apresenta reatividade na pesquisa de FAN; daí a necessidade de um valor de corte adequado. Mudanças na distribuição dos títulos dos auto-anticorpos na população são idade e sexo dependente. Craig et al. mostraram que 95% da população masculina e 95% das mulheres com menos de 20 anos apresentam reatividade em títulos menores ou iguais a 1:32. Entre mulheres acima de 40 anos, este título desloca-se para 1:128. Assim, o valor de 1:40, freqüentemente usado como valor de corte para positividade, não distingue bem doença de saúde¹⁸. Para minimizar essa situação, vários laboratórios adotam um valor de corte de 1:80^10,11. Ainda assim, até 13,3% da população sadia pode ter um teste positivo^12,19. Tan et al., após estudo multicêntrico sobre a prevalência e títulos de FAN positivo na população "sadia", recomendam a liberação do resultado na diluição de 1:40 e 1:160, acompanhado da informação sobre o percentual de falsos-positivos encontrados em cada nível de corte. Geralmente, quanto mais alto o título, mais significativo o resultado do exame, especialmente em pacientes jovens¹⁷. A Figura 3 ilustra a dispersão de títulos do FAN em algumas condições em que este exame pode estar positivo.

 

 

Em contrapartida, em situações de forte suspeita clínica, sem que haja definição quanto ao diagnóstico, pode ser útil repetir o teste no futuro, uma vez que as doenças reumatológicas são de natureza espectral². Dijkstra et al. demonstraram, em estudo prospectivo, que 58% dos pacientes com FAN positivo, que não receberam imediatamente diagnóstico de doença reumática, desenvolveram colagenoses em um período de cinco anos de seguimento. Destes, 75% receberam o diagnóstico nos dois anos seguintes, justificando a recomendação de acompanhamento mínimo por este período, desde que haja suspeita clínica de doença²¹.

Outro problema de grande importância é a variação intra e inter-laboratorial do teste, devido à sua interpretação "examinador dependente" e à falta de padronização metodológica²⁰. Em agosto de 2000, o I Consenso Brasileiro de FAN-HEp2, realizado em Goiânia, uniformizou a diversificada nomenclatura para descrição de um mesmo aspecto morfológico, eliminando uma grande fonte de confusão na interpretação dos resultados. Foi também proposto o valor de corte de 1:80 ou 1:160, conforme o microscópio utilizado^10,11. Com o II Consenso Brasileiro de FAN-HEp2, em 2002, foram organizadas as associações existentes entre os padrões de fluorescência e doenças reumatológicas auto-imunes, visando oferecer ao clínico correlações atualizadas entre a presença do(s) anticorpo(s) e doença¹².

 

PADRÕES DE FLUORESCÊNCIA EM CÉLULAS HEp-2

Os padrões observados à microscopia sugerem o tipo de anticorpo predominante no soro e a natureza do antígeno com o qual este anticorpo reage (Tabela 2). Alguns padrões de fluorescência são relativamente inespecíficos, podendo corresponder a anticorpos distintos. Alguns achados, entretanto, são correlacionados com situações clínicas especificas. No LES, a detecção dos anticorpos anti-dsDNA e anti-Sm é utilizada como um dos critérios diagnósticos. Sua presença no soro é sugerida pelos padrões de fluorescência nuclear homogêneo e pontilhado grosso, respectivamente. O anticorpo anti-topoisomerase-I corrobora o diagnóstico de esclerose sistêmica progressiva e sua pesquisa é recomendável quando ocorre padrão de imunofluorescência misto, do tipo nuclear e nucleolar pontilhado (Tabela 2). O padrão centromérico, por sua vez, corresponde ao anticorpo anti-centrômero e sugere o diagnóstico de esclerose sistêmica do tipo CREST, de melhor prognóstico. Este padrão é tão específico que dispensa a pesquisa do anticorpo por outras técnicas. Um padrão pontilhado fino é comumente relacionado à presença de anticorpos anti-SSA-Ro e SSB-La, que podem estar presentes no LES e na Síndrome de Sjögren. O encontro de anticorpos anti-histonas, correspondente ao padrão nuclear homogêneo, na ausência de outros anticorpos, é encontrado no lúpus induzido por drogas³.

 

 

Assim, o FAN-HEp-2 é um importante método de triagem, pois, possibilitando o conhecimento do(s) anticorpo(s) provavelmente envolvido(s), orienta o próximo passo na investigação e os pedidos de exames laboratoriais subseqüentes, contribuindo para a viabilidade econômica do processo diagnóstico^10,11,22.

A dosagem dos anticorpos específicos, quando indicada, pode ser feita por diversas metodologias, entre elas a imunodifusão dupla Outcherlony, hemaglutinação, enzimaimunoensaio (EIA) ou imunoblot². A Figura 4 apresenta um fluxograma para orientação do clínico na conduta laboratorial diante de um paciente com suspeita clínica de doença reumatológica sistêmica auto-imune¹⁶.

 

 

A PESQUISA DE ANTICORPOS ANTINUCLEARES POR IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO

Uma metodologia que vem ganhando cada vez mais espaço no mercado internacional é a pesquisa do FAN por imunoensaio enzimático (EIA)²³. O teste consiste na utilização de um conjunto de antígenos celulares adsorvidos na superfície interna de uma placa de poliestireno que servirá como substrato para a captura dos anticorpos porventura presentes na amostra do paciente. Estes se ligam ao(s) antígeno(s) na placa e o imunocomplexo resultante é revelado pela adição de anti-imunoglobulina humana marcada com enzima que, ao consumir um substrato específico, gera cor de intensidade proporcional à quantidade de anticorpos. O produto corado é lido por espectofotometria e os resultados são expressos em unidades numéricas, calculadas pela comparação com uma curva padrão. Esta técnica é útil, pois é passível de automação e fornece resultados semi-quantitativos independentes da habilidade do observador, dispensando a necessidade de mão-de-obra especializada^24-27. Entretanto, não fornece indicação quanto à especificidade do anticorpo envolvido no processo, o que constitui sua principal limitação^28,29 Há, ainda, a necessidade de valores de corte adequados, os quais ainda não estão bem estabelecidos.

A utilização destes imunoensaios, mais sensíveis que a imunofluorescência, tem trazido problemas na interpretação de resultados antes considerados específicos para certas condições clínicas. Medeiros demonstrou positividade para anti-Sm, considerado marcador de LES, em 2,2% dos pacientes com outras doenças reumáticas e 2,3% do grupo controle. Foi detectado anti-Scl70 em 3,6% e anti-Jo-1 em 2,5% dos pacientes reumatológicos sem diagnóstico respectivamente, de esclerose sistêmica e polimiosite³⁰.

Já existem vários kits comerciais no mercado e diversos trabalhos científicos avaliando os seus desempenhos em comparação à técnica de imunofluorescência em células HEp-2^28,31,32. Tais estudos comparativos mostram que a sensibilidade e especificidade variam significativamente entre os imunoensaios enzimáticos, geralmente na dependência do substrato utilizado³³. O emprego de extrato de núcleo das células HEp-2 tem a vantagem de capturar todos os anticorpos anti-celulares potenciais. Por outro lado, quando é utilizada uma mistura de antígenos sintetizados por técnicas recombinantes, a sensibilidade do kit deve ser confirmada pelo laboratório, pois a ausência de algum antígeno importante na preparação antigênica pode levar a maior taxa de resultados falsos negativos²⁹.

 

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A pesquisa de auto-anticorpos que reagem com constituintes celulares constitui uma ferramenta essencial para o diagnóstico das doenças auto-imunes. Seu valor depende da especificidade e sensibilidade intrínsecas do teste, mas, principalmente, de seu valores preditivos, diretamente relacionados à prevalência da doença na população testada. Suarez-Almazor et al. constataram valores preditivos positivos diferentes entre clínicos gerais e reumatologistas. Entre estes últimos, cujos pacientes apresentavam maior prevalência de doença reumática, o valor preditivo positivo do FAN foi significativamente maior. Isso se deve, em grande parte, à utilização indiscriminada do exame pelos clínicos³⁴. Pacientes com, por exemplo, doença extra-articular isolada ou sintomas constitucionais não específicos, como fadiga, apresentam poucas chances de ter doença reumática associada com FAN positivo. Uma seleção mais criteriosa dos pacientes seria capaz de melhorar o valor preditivo positivo do teste. Por outro lado, o FAN tem um excelente valor preditivo negativo - praticamente 100% - de modo que, em face de um teste negativo, pode ser necessário reconsiderar a suspeita diagnóstica^34,35.

Dessa forma, o exame bem indicado, sustentado por uma suspeita clínica consistente e que, por sua vez, é bem interpretado pelo médico assistente, contribuirá não só para o acerto do diagnóstico, como também para a orientação da propedêutica subseqüente, diminuindo o volume de exames, reduzindo custo e trabalho, encaminhamentos desnecessários e terapia inapropriada.

 

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