RMMG - Revista Médica de Minas Gerais

Artigos Originais

Análise da reatividade do padrao anéis e bastoes em diferentes kits FAN HEp-2

Reactivity analisys of "rods and rings" pattern in diferent HEp-2 ANA kits

Bruno de Assis Coelho¹; Carla Márcia Leal Lunardi¹; Glauco Frederico Rodrigues Pimenta¹; Maria Luiza Peloso Maia¹; Paulo Henrique Brasil Vieira¹; Rômulo Carvalho Vaz de Melo²

1. Acadêmico (a) do Curso de Medicina. Fundaçao José Bonifácio Lafayette de Andrada - FUNJOBE. Faculdade de Medicina de Barbacena - FAME. Barbacena, MG - Brasil
2. Professor. FUNJOBE/FAME. Barbacena, MG - Brasil

Endereço para correspondência

Rômulo Vaz de Melo
E-mail: romulovm@gmail.com

Instituiçao: Faculdade de Medicina de Barbacena Barbacena, MG - Brasil

Resumo

OBJETIVO: comparar a reatividade para o padrao "anéis e bastoes" em diferentes kits comerciais de fator antinúcleo (FAN) HEp-2.
METODOLOGIA: foram analisadas três amostras sorológicas com sabida reatividade para o padrao "anéis e bastoes", em cinco kits comerciais de FAN HEp-2.
RESULTADOS: dos cinco kits comerciais testados, dois - EUROIMMUN^® E INOVA^® - apresentaram reatividade para o padrao "anéis e bastoes" e três - WAMA^®, VIROIMMUN^® e BION^® - não mostraram reatividade.
CONCLUSÃO: os diferentes kits comerciais de FAN HEp-2 disponíveis no mercado não têm homogeneidade na reatividade para o padrao "anéis e bastoes".

Palavras-chave: Imunofluorescência; FAN HEp-2.

 

INTRODUÇÃO

A pesquisa de autoanticorpos pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI), também denominada fator antinúcleo (FAN), foi descoberta em meados do século XX pelos pesquisadores Coons e Kaplan. O método era baseado na detecção de anticorpos que reagem a antígenos nas células e nos órgaos de portadores de doenças autoimunes, em amostra de tecido de roedores. Posteriormente, esse substrato foi substituído por células tumorais derivadas de carcinoma de laringe humana - células HEp-2,^1,2 o que possibilitou a análise minuciosa dos compartimentos celulares e os anticorpos neles depositados que podem ocorrer em núcleo, nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico.³ Após essa modificação houve grande aumento na sensibilidade do teste, ampliando de forma significativa o número de padroes de FAN que podem ser detectados.

A pesquisa de autoanticorpos pelo FAN HEp-2 em imunofluorescência indireta (IFI) é hoje o teste laboratorial de escolha na investigação inicial de doenças autoimunes^4,5 e tem sido amplamente utilizada por médicos de várias especialidades no diagnóstico precoce de doenças autoimunes, como LES, esclerose sistêmica, síndrome de Sjögren, artrite reumatoide, doença mista do tecido conjuntivo, polimiosite, síndrome antifosfolípide e outras.^6,7 Todavia, a prescrição indiscriminada do exame, sem critérios clínicos para a indicação do teste, levou ao aumento no número de resultados positivos em pacientes hígidos, devido ao fato de que a presença de autoanticorpos não é específica de autoimunidade, pois condições inflamatórias crônicas, neoplasias, entre outros, podem cursar com autoanticorpos.

No mercado laboratorial existem diversas marcas que se destinam à pesquisa de autoanticorpos pelo método de FAN HEp-2 e, apesar de haver certo grau de padronização entre os diferentes kits, os resultados encontrados com um substrato HEp-2 de um fornecedor nem sempre vai ser reproduzido com outro, mostrando que ainda se necessita de mais padronização por parte dos fabricantes. Dessa forma, estudos que avaliam o grau de concordância dos kits na demonstração dos padroes são extremamente relevantes. ⁸

Um dos padroes de FAN que não apresentam boa concordância entre os diversos substratos é "anéis e bastoes", padrao descrito recentemente, comumente associado a portadores de hepatite por vírus C. É comum que esse padrao seja expresso em um substrato e não em outro, fazendo com que o mesmo paciente possa ter resultados distintos quando realizados em laboratórios que utilizam kits comerciais diferentes.^4,9

Desse modo, este estudo objetiva comparar a reatividade para o padrao "anéis e bastoes" em diferentes kits comerciais de fator antinúcleo (FAN) HEp-2.

 

METODOLOGIA

Delineamento do estudo

Trata-se de estudo transversal analítico utilizando-se amostras sorológicas de pacientes que realizaram exames laboratoriais de rotina oriundas laboratório Geraldo Lustosa, em Belo Horizonte. As análises para comparar a reatividade do padrao de FAN anéis e bastoes em cinco kits diferentes utilizando substratos de células HEp-2 foram realizadas no Setor de Soroimunologia e Hormônios do Laboratório São José, em Barbacena.

Amostras

Para a realização do estudo, foram analisadas amostras sorológicas obtidas do sangue de pacientes que compareceram ao laboratório Geraldo Lustosa, em Belo Horizonte, para exames laboratoriais de rotina. As amostras foram transportadas em veículo de empresa terceirizada, especializada em transporte de material biológico, à temperatura de -12°C. A partir das amostras do referido laboratório, foram selecionadas e testadas três amostras sorológicas com sabida reatividade para o padrao "anéis e bastoes" em cinco kits comerciais (VIROIMMUN^®, EUROIMUMM^®, BION^®, WAMA^® e INOVA^®) de FAN HEp-2. Essas amostras estavam armazenadas no referido laboratório sem qualquer identificação dos pacientes e seriam posteriormente descartadas

Análises

Todas as análises foram realizadas no Setor de Soroimunologia e Hormônios do Laboratório São José, em Barbacena. Foram utilizados cinco diferentes kits comerciais de FAN HEp-2, das seguintes marcas: VIROIMMUN^®, EUROIMUMM^®, BION^®, WAMA^® e INOVA^®. As leituras da fluorescência foram realizadas em um microscópio de fluorescência da marca Olympus, modelo BX 60, em aumento de 100x e 400x, por dois observadores com no mínimo cinco anos de experiência.

As amostras foram classificadas como reagentes ou não reagentes de acordo com o resultado da positividade ou negatividade para o padrao "anéis e bastoes" nos diferentes kits comerciais. O valor da titulação, diluição, foi de 1:80.

Aspectos de éticos

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética, sob o número do parecer 909.006.

Análise estatística

A análise do grau de concordância entre os resultados das amostras foi realizada pelo teste Kappa, com cálculo do valor de p. Considerou-se como grau de concordância "fraco" índice de Kappa inferior a 0,4; grau de concordância "moderado" com Kappa entre 0,4 e 0,7; e o grau "forte" considerado com Kappa superior a 0,7.

 

DISCUSSÃO

Entre os resultados dos testes EUROIMUMM^® e INOVA^® (primeiro grupo), houve concordância de 100%, sendo, portanto, o índice Kappa igual a 1. Comparando os resultados dos testes VIROIMMUN^®, BION^® e WAMA^® (segundo grupo), também houve concordância de 100%, sendo, portanto, o índice Kappa igual a 1. Por outro lado, comparando qualquer dos testes do primeiro grupo com qualquer dos testes do segundo grupo, o resultado do teste de concordância foi zero. Portanto, em relação à intensidade de concordância, os kits concordam e discordam totalmente (Tabela 1).

 

 

A padronização do teste de FAN HEp-2 é objeto de estudo há alguns anos, como demonstrado na literatura.^10,11 Para que os resultados liberados pelos laboratórios sejam precisos e reprodutíveis, a uniformidade dos kits se faz necessária, otimizando a interpretação adequada desses resultados pelo médico e fazendo com que o paciente não seja investigado de maneira desnecessária, no caso de resultados não reagentes ou mesmo reagente, mas com padroes de imunofluorescência pouco associados a doenças autoimunes, aumentando ainda mais os custos pela realização de novos testes. ^10-12

O 3° Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em células HEp-2 relata a necessidade de os laboratórios realizarem a titulação dos conjugados fluorescentes utilizados na realização do teste, em virtude da heterogeneidade dos equipamentos utilizados para a leitura dos testes nos laboratórios. Mostrou-se que existe grande variabilidade entre os conjugados dos kits comerciais, apesar de já existirem critérios bem-definidos na literatura em relação às especificações analíticas dos conjugados. É importante ressaltar ainda que, além da verificação da titulação do conjugado, é necessária a checagem rotineira das objetivas e dos filtros e da lâmpada do microscópio, que interferem na definição do título do conjugado e checagem do tempo de lâmpada e se a mesma está centrada.^10,11

Nosso estudo demonstrou que os resultados de soros reagentes para o padrao "anéis e bastoes" obtidos em um determinado kit de FAN HEp-2 não são reprodutíveis em outros diferentes kits comerciais, sendo que 60% dos substratos analisados HEp-2 não expressaram os antígenos para ligação dos anticorpos e visualização do referido padrao de IFI. Esse padrao é mais comumente visto em pacientes portadores de hepatite C, especialmente nos que realizam tratamento com combinação das drogas ribavirina + interferon.^13,14 Pesquisas recentes demonstram que o padrao anéis e bastoes não esteve relacionado ao genótipo do vírus, à carga viral ou às características demográficas dos pacientes, acreditando-se estar relacionado ao tratamento sem interferência na resposta do paciente, sendo que a ribavirina induz a apresentação do padrao nas células em cultura.¹⁵ Pesquisas recentes revelaram como antígenos-alvo as enzimas inibidas pela ribavarina, citidina-trifosfato sintase (CTPS) e inosina-5'-monofosfato desidrogenase 2 (IMPDH2). Averiguou-se que IMPDH2 é de fato o principal alvo dos anticorpos antianéis e bastoes, enquanto CTPS é um alvo improvável. ^16,17 Os mecanismos responsáveis pela produção desses anticorpos em portadores crônicos de hepatite C permanecem obscuros, todavia, é possível que esses autoanticorpos estejam associados à falta de resposta ao tratamento e mais chance de recidiva.^18,19

Nossos resultados reforçam a necessidade de que, durante a elaboração do laudo por parte do laboratório, o médico solicitante seja informado de que o reconhecimento desse padrao é substrato-dependente, evitando a realização de repetições e testes desnecessários para esclarecimento do quadro. Do lado do médico solicitante, torna-se fundamental que este, necessitando confirmar a positividade para esse anticorpo, informe ao laboratório, para que a reação seja realizada em substratos que sabidamente possuem os antígenos-alvo que possibilitem a detecção.^9-11

 

CONCLUSÃO

De acordo com os diferentes resultados obtidos no experimento, não houve homogeneidade entre os kits comerciais FAN HEp-2 para amostras sabidamente positivas para o padrao "anéis e bastoes". Contudo, os resultados encontrados podem apenas ser aplicados aos kits referidos no experimento, não podendo estimar a concordância em relação às diversas outras marcas existentes no mercado.

 

REFERENCIAS

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