RMMG - Revista Médica de Minas Gerais

Artigo Original

Efeitos do Cryptococcus neoformans na ativação de células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas (células A549)

Effects of Cryptococcus neoformans on activation of human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells (A549 cells)

Karina Cristina da Cruz Freitas¹; Wanessa Maria Santos¹; Aline Beatriz Mahler Pereira¹; Leonardo Euripedes Andrade-Silva²; Paulo Roberto da Silva¹; Mario Leon Silva Vergara³; Alexandre de Paula Rogerio*¹

1. Institute of Health Sciences, Department of Biomedicine, Laboratory of Experimental Immunopharmacology, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais, Brasil
2. Infectious Diseases Unit, Internal Medicine Department, EBSERH, Federal University of Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais, Brasil
3. Institute of Health Sciences, Department of Internal Medicine, Laboratory of Mycology, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais, Brasil

Endereço para correspondência

Alexandre de Paula Rogério
Department of Biomedicine, Laboratory of Experimental Immunopharmacology, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Minas Gerais, Brasil
E-mail: alexandre.rogerio@uftm.edu.br

Recebido em: 23 Novembro 2023.
Aprovado em: 3 Março 2024.

Editor Associado Responsável: Dr. Henrique Vitor Leite
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.
Belo Horizonte/MG, Brasil.
Fontes apoiadoras: Este trabalho foi financiado por Auxílios do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (no. 475349/2010-5), Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG; APQ 01631/11 e APQ-01873- 14), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG (Rede Mineira de Pesquisa Translacional em Imunobiológicos e Biofármacos no Câncer [REMITRIBIC, RED-00031-21]). Este estudo foi parcialmente financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código Financeiro 001.
Conflito de Interesse: Não há.
Comitê de Ética: Não se aplica.

Resumo

INTRODUÇÃO: O epitélio brônquico possui mecanismos de defesa baseados na imunidade inata contra diversos microrganismos veiculados pelo ar, entre eles o Cryptococcus neoformans.
OBJETIVO: Avaliamos os efeitos inflamatórios de C. neoformans usando células de adenocarcinoma epitelial basal alveolar humano (células A549).
MÉTODOS: Células A549 foram expostas ao C. neoformans (Multiplicidade de Infecção - MOI 1:100) e as análises foram realizadas 24 horas após o estímulo.
RESULTADOS: C. neoformans aumentou a produção de IL-6 e TGF-β1, mas não de IL-8 e IL-10, e ativou a fosforilação de ERK1/2 e NF-B em células A549 quando comparado ao grupo controle. Houve maior adesão de C. neoformans quando comparada à internalização em células A549.
CONCLUSÃO: O C. neoformans é capaz de promover alterações nos parâmetros inflamatórios em células epiteliais basais alveolares de adenocarcinoma humano.

Palavras-chave: Células A549; Cryptococcus neoformans.

 

INTRODUÇÃO

A criptococose é uma doença infecciosa presente mundialmente com mais de 70 espécies descobertas, mas apenas duas espécies são consideradas patogênicas em humanos: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii^1,2. A grande maioria das infecções por cryptocócicas são causadas por C. neoformans principalmente em pacientes imunocomprometidos. As células epiteliais das vias aéreas são as primeiras células hospedeiras com as quais o Cryptococcus spp. tem contato próximo^3,4.

As infecções pulmonares em indivíduos saudáveis geralmente se resolvem por conta própria; no entanto, em indivíduos com condições de imunossupressão, como pacientes com HIV/AIDS, pacientes com transplante sólido e pacientes com câncer, o C. neoformans pode ter mais facilidade em escapar da resposta imune e dos pulmões, espalhando-se pelo corpo até atingir o local onde tem predileção - o cérebro, causando meningite criptocócica ou meningoencefalite^5,6.

A célula A549, linhagem epitelial alveolar humana tipo II, originada de tecido de carcinoma pulmonar de paciente humano, é utilizada para estudos farmacológicos, toxicológicos e microbiológicos^4,7,10, incluindo estudos com C. neoformans^3-14.

Neste estudo, avaliamos, in vitro, o efeito de C. neoformans sobre a ativação de A549, como a produção das citocinas IL-6, IL-8, IL-10 e TGF-β1, e a ativação da fosforilação de transcrição dos fatores ERK1/2 e NF-kB, além da infectividade fúngica na célula.

 

MÉTODOS

Células

Células A549 (doadas pelo Dr. David Bruce Levy do Brigham and Women's Hospital) foram cultivadas em meio DMEM/F-12 (Gibco - Life Technologies) mais 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gibco - Life Technologies) e 1% de antibióticos (penicilina, estreptomicina e gentamicina) (Gibco - Life Technologies) em frascos de cultura (TPP) com área de crescimento de 75 cm² e volume de 65 mL, mantidos em estufa a 37 °C com 5% de CO₂.

C. neoformans

Todos os experimentos foram realizados com C. neoformans var. grubii cepa H99 (ATCC MYA-4564). O C. neoformans foi cultivado e mantido em ágar Sabouraud dextrose (BD Biosciences). Para a estimulação celular, uma única suspensão de colônia em caldo Sabouraud dextrose (BD Biosciences) foi preparada após o crescimento até a fase estacionária inicial (48h) a 37 °C.

Estimulação

Células A549 (1 x 10⁵ cel/mL) foram incubadas em placas de 96 poços e estimuladas com C. neoformans (Multiplicidade de Infecção - MOI 1:100; 100 fungos para 1 célula)⁸ por 24h.

Produção de IL-6, IL-8, IL-10 e TGF-β1

Os sobrenadantes foram coletados 24h após a estimulação, e as concentrações de IL-6, IL-8, IL-10 e TGF-β1 foram medidas por ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA).

Expressões de fosfo-NF-B e fosfo-ERK1/2

As vias de sinalização do fosfo-NF-B e ERK1/2 foram avaliadas por citometria segundo Oliveira et al. (2015)¹². Resumidamente, 24h após a estimulação com C. neoformans, as células foram fixadas com BD Cytofix Buffer (4%) durante 10 min a 37 °C. Após a centrifugação, as células foram permeabilizadas em paraformaldeído gelado por 30 minutos e então coradas com monoclonais anti-fosfo-NF-B ou anti-fosfoERK1/2 (BD Biosciences Pharmingen-Phosflow, EUA) ou seu isotipo correspondente por 60 minutos seguido de incubação com o anticorpo secundário marcado com FITC ou PE por mais 45 minutos no escuro. As células foram então lavadas, ressuspensas e submetidas a análise.

Uma expressão de moléculas sinalizadoras intracelulares fosforiladas em 50.000 células viáveis foi analisada por citometria de fluxo (FACSCalibur; BD Biosciences Pharmingen).

Fagocitose in vitro

Para determinar os níveis de internalização de C. neoformans durante as adesões com células A549, o método de Pereira et al. (2021)⁹ foi seguido. Resumidamente, as células de levedura foram marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) a 0,1 mg/mL, no escuro, por 30 min, e após lavagem em PBS. Células A549 foram estimuladas com C. neoformans por 24h a 37 °C, seguido de lavagem com PBS (3 vezes usando 1 mL cada) para remoção de fungos não aderentes. Alguns dos complexos de células hospedeiras de fungos foram tratados por 10 min a 25 °C com azul de tripano (200 μg/ml). O azul de tripano é um agente supressor da fluorescência derivada do FITC e, como não é capaz de atingir o compartimento intracelular de células viáveis, esse corante é útil para discriminar C. neoformans intracelular e associado à superfície, extinguindo, assim, a fluorescência de não internalizados células. O azul de tripano não ligado foi removido por lavagem extensa com PBS e os complexos foram então analisados por citometria de fluxo.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software "Prisma" versão 5 da Graphpad (http://www.graphpad.com). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. A avaliação dos resultados foi realizada pela análise de variância (ANOVA), seguida do pós-teste de Tuckey. Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 

Resultados

A produção de IL-6 e TGF-β1 foi aumentada em células A549 infectadas com C. neoformans

Primeiramente, avaliamos o efeito de C. neoformans na produção das citocinas IL-6, IL-8, IL-10 e TGF-β1 em A549. Células A549 infectadas com C. neoformans aumentaram significativamente a concentração de IL-6 (Figura 1A) e TGF-β1 (Figura 1D) quando comparadas ao grupo-controle. Não foram observadas alterações na produção de IL-8 (Figura 1B) e IL-10 (Figura 1C) entre os grupos.

 

 

Células A549 foram estimuladas com C. neoformans (MOI 100) por 24h. As concentrações de IL-6 (A), IL-8 (B), IL-10 (C) e TGF-β1 (D) foram avaliadas por ELISA. Os dados são a média ± SEM de três experiências independentes em triplicado (n=10).

C. neoformans aumentou a fosforilação de ERK1/2 e NF-B em células A549

C. neoformans aumentou significativamente a fosforilação de ERK1/2 (Figura 2A) e NF-B (Figura 2B) em células A549 em comparação com grupos de controle.

 

 

 

 

Após 24h, as células foram recuperadas e a citometria de fluxo mostrando porcentagens de ERK1/2 (A) e NF-B (B) foram analisadas. Os dados são a média ± SEM de três experiências independentes em triplicado (n=4).

Adesão e internalização de C. neoformans em células A549

O número de células internalizadas por C. neoformans é muito menor do que a quantidade aderida nas células A549.

C. neoformans foi incubado com FITC (0,1 mg/mL) no escuro por 30 min. A549 foram estimulados com C. neoformans (MOI 100). Após 24h, as células foram recuperadas e analisadas por citometria para determinar a quantidade na superfície (barra branca) e intracelular (barra cinza) de C. neoformans foi então analisada por citometria de fluxo. Os dados são a média ± SEM de três experiências independentes em triplicado (n=8).

 

DISCUSSÃO

O papel das células epiteliais na resposta inflamatória a C. neoformans é pouco explorado. C. neoformans é capaz de modular diversas respostas pulmonares e pode exacerbar ou limitar a ativação de certos mediadores das células epiteliais. Embora existam vários modelos animais de infecções criptocócicas, as diferenças entre células pulmonares de camundongos e humanos prejudicam uma visão mais ampla de como C. neoformans interage com o epitélio pulmonar¹⁵. A célula A549, uma linha celular derivada de um adenocarcinoma pulmonar humano¹⁶, tem se mostrado muito útil em diversos estudos farmacológicos, toxicológicos e microbiológicos^15,9 inclusive em C. neoformans³.

A IL-6 desempenha um papel fundamental na inflamação e infecção¹⁶. Camundongos knockout para IL-6 infectados com C. neoformans aumentaram a quebra da barreira hematoencefálica, causando morte mais rápida em comparação com camundongos selvagens¹⁷. Reforçando isso, em um estudo de pacientes positivos para o vírus da imunodeficiência humana com meningite criptocócica, a alta concentração de IL-6 no líquido cefalorraquidiano foi associada a respostas protetoras do hospedeiro, como controle de infecção e integridade da barreira hematoencefálica¹⁸. C. neoformans aumentou a produção de IL-6 em células A549 correspondendo a uma resposta inflamatória imune inata à infecção fúngica. Como a IL-6 desempenha um papel significativo na inflamação das vias aéreas e no controle de infecções fúngicas, sua produção pelas células imunes inatas das vias aéreas poderia favorecer os mecanismos de proteção das vias aéreas e diminuir a suscetibilidade ao desenvolvimento criptocócico.

A IL-8 é um mediador quimiotático, principalmente para neutrófilos, que atua na defesa do hospedeiro contra fungos, bactérias e vírus^19,20,21. No trabalho de Guillot et al. (2008)²², observou-se que C. neoformans acapsulares viáveis são potentes ativadores de células epiteliais brônquicas humanas (BEAS-2B), induzindo uma secreção significativa de IL-8, que corresponde a uma resposta inflamatória aguda na célula. No entanto, em nosso experimento, nenhuma alteração significativa na produção de IL-8 foi observada entre as células controle e infectadas.

A IL-10 é uma citocina com efeitos anti-inflamatórios e imunossupressores, auxiliando na redução da inflamação. O aumento da produção de IL-10 em amostras de sangue periférico de pacientes com criptococose geralmente está relacionado à disseminação da doença e mortalidade precoce^22,23. A IL-10 faz parte da imunidade Th2 relacionada à disseminação da doença no hospedeiro. C. neoformans não aumentou a produção de IL-10 em células A549. Esse resultado pode sugerir que C. neoformans não modula o mecanismo anti-inflamatório da IL-10 em células A549 em favor da suscetibilidade à infecção criptocócica.

O TGF-β1 é uma citocina multifuncional que desempenha papel central na patogênese de diversas doenças crônicas na regulação de respostas inflamatórias^24,25. C. neoformans aumentou a produção de TGF-β1 em células A549. O aumento de TGF-β1 pode contribuir para a persistência da infecção criptocócica durante as fases crônicas da infecção, conforme visto em Shao et al. (2005)²⁶.

O NF-κB atua na inflamação e na resposta do hospedeiro a várias infecções^26,27. Pereira et al. (2021)⁹ observaram que a atividade de NF-κB em células epiteliais brônquicas (células BEAS-2B) poderia ser desnecessária para o desenvolvimento de inflamação das vias aéreas em resposta a C. neoformans. Este trabalho está de acordo com McDermot et al. (2018)²⁸, que demonstraram, no modelo camundongo de criptococose, que a sinalização de NF-κB em células epiteliais pulmonares é totalmente dispensável para a inflamação das vias aéreas em resposta a C. neoformans. Em nosso estudo, C. neoformans aumentou a ativação de fosfo-NF-kB em células A549 quando comparado aos controles. Esses resultados estão em desacordo com estudos anteriores e podem estar relacionados a diferenças de modelos (in vivo e in vitro) ou células (células BEAS-2B e A549) utilizadas. No entanto, esses resultados estão associados a um aumento de IL-6, que pode ser produzida pelo NF-κB^28,29.

Uma outra importante via de sinalização para a inflamação é a quinase regulada por sinal extracelular 1/2 (ERK), que participa de importantes processos regulatórios como adesão celular, progressão do ciclo celular e migração celular³⁰. Estudos demonstraram que a cápsula GXM de C. neoformans tem a capacidade de diminuir a ativação de ERK1/2 em camundongos CD45+ tipo selvagem^4,10. Pereira et al. (2021)⁹ observaram que a atividade de ERK1/2 em células epiteliais brônquicas (células BEAS-2B) pode ser desnecessária para o desenvolvimento de inflamação das vias aéreas em resposta a C. neoformans. Observamos um aumento da fosforilação de ERK1/2 por C. neoformans em células A549. As diferenças entre nossos resultados e os demais podem estar relacionadas aos tipos de células utilizadas nos experimentos e modelos in vitro e in vivo, bem como ao uso de polissacarídeo fúngico em vez de células fúngicas vivas. O aumento de ERK1/2 poderia estar associado ao processo inflamatório em favor do controle da infecção por C. neoformans nas vias aéreas.

A capacidade das células criptocócicas de aderir à superfície pulmonar do hospedeiro é importante para o estabelecimento da doença^3,4. Vários artigos foram publicados tentando investigar os mecanismos de adesão e internalização do fungo a C. neoformans em células epiteliais do trato respiratório^5,31-34. Observamos tanto internalização como adesão de C. neoformans em células A549, o que poderia favorecer as lesões primárias nas vias aéreas^35,36.

 

CONCLUSÃO

O epitélio pulmonar é um componente da resposta imune inata e demonstra um papel multifuncional além de uma barreira física protetora entre o ambiente externo e os tecidos através da liberação de uma série de mediadores, como citocinas e quimiocinas, que podem orquestrar e influenciar as respostas imunes inatas e adaptativas na modulação da inflamação das vias aéreas. Dessa forma, nossos resultados demonstraram que C. neoformans é capaz de ativar e interagir com células epiteliais basais alveolares do adenocarcinoma humano, modulando a resposta imune inata das vias aéreas a seu favor para promover o desenvolvimento de infecções criptocócicas.

 

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES

As contribuições dos autores estão estruturadas de acordo com a taxonomia (CRediT) descrita abaixo:

Conceitualização, Investigação, Metodologia, Visualização & Redação - revisão e edição: KCCF. Concebeu e projetou a análise; coletou os dados, realizou a análise, escreveu o artigo: Realizou a análise e escrita: WMS. Realizou a análise e escrita: ABMP. Realizou a análise e escrita: ALEA-S. Redação e aquisição de recursos e financiamento: PRS. Supervisão, redação e aquisição de recursos e financiamento: MLSV. Administração do projeto, supervisão, redação e aquisição de recursos e financiamento: APR. Todos os autores discutiram, leram e aprovaram a versão final do capítulo.

 

COPYRIGHT

Copyright^© 2021 Freitas et al. Este é um artigo em acesso aberto distribuído nos termos da Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Licença Internacional que permite o uso irrestrito, a distribuição e reprodução em qualquer meio desde que o artigo original seja devidamente citado.

 

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