ISSN (on-line): 2238-3182
ISSN (Impressa): 0103-880X
CAPES/Qualis: B2
Efeitos da sinvastatina sobre propriedades biomecânicas de ossos de ratas ovariectomizadas
Effects of sinvastatin on bones biomechanical properties in ovariectomizade rats
Robéria Mota da Silva1; Francisco da Cunha Pinheiro Neto1; Dernival Bertoncello2
1. Fisioterapeuta, UNIUBE
2. Doutor em Ciências Fisiológicas, UNIUBE
Universidade de Uberaba/UNIUBE
Rua: Pernambuco, 725 apto 302 Bairro: Santa Maria
CEP 38050-420 Uberaba - MG
E-mail: dernival.bertoncello@uniube.br
Resumo
OBJETIVO: este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da sinvastatina sobre parâmetros biomecânicos do tecido ósseo de ratas ovariectomizadas, enfatizando a avaliação da resistência óssea.
MATERIAL E MÉTODOS: foram utilizadas ratas Wistar de quatro meses de idade, submetidas previamente à ovariectomia (ovx). Os animais foram divididos em quatro grupos: 1) intactas, 2) intactas + sinvastatina, 3) ovx + sinvastatina, 4) ovx + salina. A sinvastatina, na dose de 5 mg/kg/dia, foi administrada por gavagem, seis dias/semana durante oito semanas. A salina foi administrada na dose de 0,1 mL/100g. Foram analisados peso corporal, rigidez óssea, propriedades físicas do osso e propriedades biomecânicas do fêmur pelo teste de flexão de três pontos.
RESULTADOS: houve diferenças significativas para carga máxima (em Newtons) entre os grupos ovx + sinvastatina (115,08±2,49) e intactas + sinvastatina (114,67±2,22) quando comparados ao grupo das intactas (89,68±3,06) e entre os grupos das ovx + sinvastatina e ovx + salina (95,5±1,22). Em relação à rigidez óssea (N/mm), os grupos ovx + sinvastatina (87,88±8,48) e intactas + sinvastatina (91,56±6,30) apresentaram valores significativamente mais altos do que o grupo intactas (61,93±5,87). O grupo ovx + sinvastatina (145,00±2,49) apresentou maior ganho de massa corporal (g) quando comparado ao grupo das ratas intactas (113,00±3,06) e ao grupo ovx + salina (120,33±1,21).
CONCLUSÃO: infere-se, assim, que a sinvastatina protegeu o tecido ósseo dos animais quanto à perda de resistência provocada pela osteopenia.
Palavras-chave: Osso e Ossos/efeitos de drogas; Osteopatias Metabólicas; Sinvastatina; Ovariectomia.
INTRODUÇÃO
A osteoporose corresponde hoje à mais freqüente das doenças osteometabólicas, sendo considerada um problema mundial de saúde pública.1 Estima-se que em todo o mundo 200 milhoes de pessoas sejam atingidos por essa afecção e tal situação tem tendência a se agravar nos próximos anos, devido ao aumento da expectativa de vida.2 Portanto, os custos assistenciais tornam-se cada vez mais impraticáveis, principalmente para países em desenvolvimento, sendo indispensável os investimentos em pesquisa que possam resultar em estratégias para prevenir ou amenizar o quadro.2,3
Algumas mulheres, no período da menopausa, apresentam perda de massa óssea em decorrência da redução do estrógeno. A diminuição de massa óssea consiste na osteopenia sem que haja, no entanto, comprometimento da arquitetura óssea.4,5 Essa perda pode variar de 1 a 5% ao ano, caracterizando a osteoporose pós-menopausa.6 Existem vários fatores relacionados ao surgimento da osteoporose, os genéticos são responsáveis por quase 80% dessa alteração de massa óssea. Outros fatores que também estao relacionados à diminuição acentuada de massa óssea são os nutricionais, ambientais, desordens hormonais e a falta de atividade física regular.7,8
A osteoporose torna o osso menos resistente a diferentes estímulos relacionados a cargas, devido à diminuição na quantidade de tecido, o que leva a amplos canais internos de reabsorção. Porém, a concentração de cálcio é normal na matriz orgânica. Essa situação decorre de três fatores principais: diminuição na formação óssea; aumento na reabsorção do osso formado; ou a combinação desses dois fatores.2
A fisiopatologia dessa afecção osteometabólica envolve a diminuição de fatores de crescimento, como o IGF-1 (fator de crescimento insulina-dependente) e a prostaglandina E2 (PGE2), além de citocinas. Há especulações quanto à interleucina 6 (IL-6) ser a citocina de maior relevância quando se tem uma disfunção gonadal, sendo a IL-1, IL-11 e o fator de necrose tumoral (TNFα) também responsáveis por essa perda causada pela deficiência estrogênica. Porém, ao contrário da IL-6, essas citocinas não são suprimidas pelos hormônios esteroidais.9
Recentemente, tem-se discutido a ação das estatinas sobre o tecido ósseo.10,11 A literatura já comprova a atuação dessa substância no controle da hipertensão12 e regulação dos níveis séricos de colesterol.13,14 Esse fármaco tem como mecanismo de ação a inibição da enzima HMG-CoA redutase, que catalisa a conversão da HMG-CoA a ácido mevalônico, precursor do colesterol. A inibição dessa enzima leva à diminuição da síntese hepática de colesterol, resultando em aumento da produção de receptores de LDL na superfície dos hepatócitos, aumentando, assim, a depuração de LDL. As estatinas são bem absorvidas e extraídas pelo fígado, seu local de ação, onde são metabolizadas para sua forma ativa, o ácido graxo B-hidroxi.15
A terapêutica mais comumente utilizada no tratamento da osteoporose é a reposição hormonal associada a algumas medidas gerais, como ingestao de cálcio e atividade física. Devido ao fato de estudos recentes indicarem efeitos da sinvastatina no metabolismo do tecido ósseo, o objetivo deste trabalho foi verificar possíveis efeitos da sinvastatina em prevenir a perda de resistência óssea em ratas ovariectomizadas, a partir de teste biomecânico.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas 40 ratas wistar com quatro meses de idade, massa corporal de 170-200 g no início do experimento, provenientes do Biotério Central da Universidade de Uberaba, Uberaba, MG, Brasil.
Para a realização do trabalho, conforme as normas do comitê de ética em pesquisa institucional, foram seguidos todos os princípios propostos por alguns autores16 e ratificados pela UNESCO, em 1978, que elaborou a Declaração dos Direitos dos Animais. O experimento norteou-se de acordo com todos os cuidados necessários para evitar o sofrimento de cada animal.17
Os animais inicialmente foram divididos nos seguintes grupos, cada um contendo 10 ratas: 1) intactas (int); 2) intactas tratadas com sinvastatina (int + sinv); 3) ovariectomizadas tratadas com sinvastatina (ovx + sinv); 4) ovariectomizadas tratadas com salina (ovx + salina). A ovariectomia foi realizada conforme técnica descrita por Zarrow et al.18.
Os tratamentos foram iniciados 24 horas após a castração. Foram realizados precocemente devido ao objetivo de se avaliar a prevenção à osteoporose. A sinvastatina foi administrada na dose de 5,0 mg/kg de peso corporal, diariamente, por gavagem, uma vez ao dia.19,20 A salina foi administrada na dose de 0,1 mL/100 g de massa corporal. Os animais foram pesados diariamente para cálculo da solução a ser injetada, de acordo com o peso de cada um deles. Os tratamentos se estenderam por oito semanas (seis dias por semana), período em que os animais tiveram comida (ração comercial) e água à vontade e permaneceram no biotério em ambiente controlado quanto à temperatura e luminosidade. Conforme dados da literatura, após esse período de oito semanas é possível verificar significante perda de massa óssea.21-23
Ao final do experimento, os animais foram sacrificados utilizando-se éter etílico. Foram retirados os fêmures, dissecados e mantidos em salina a 0,9% e -20º C. Os ossos foram descongelados à temperatura ambiente 12 horas antes de se iniciarem as análises.
Para avaliação dos efeitos biomecânicos da sinvastatina, foi realizado o teste biomecânico de flexão de três pontos no fêmur direito. Os ensaios mecânicos foram feitos numa máquina de ensaio universal pertencente ao Laboratório de Pesquisa em Materiais Odontológicos da Universidade de Uberaba, à temperatura ambiente, conforme técnica já descrita na literatura.24,25 As extremidades do fêmur ficaram apoiadas em dois roletes com diâmetro de 3,0 mm, suportados por apoios distanciados de 21,0 mm.
A força foi aplicada perpendicularmente ao eixo longitudinal do osso, no sentido póstero-anterior, no meio da distância entre os dois apoios, por uma haste cilíndrica com um rolete fixado na sua extremidade, em velocidade constante de 0,5 cm/min até o momento da ruptura do osso. Considerou-se, para análise, a carga máxima suportada. Foi utilizada a célula de carga de capacidade máxima de 50 kgf. Foram registrados os valores de carga máxima obtidos durante o teste. A partir do gráfico, procurou-se relacionar a carga com a deformação óssea (em mm) para a verificação da rigidez óssea (N/mm), que representa a capacidade do osso de resistir a uma carga considerando-se sua superfície.
Após o teste biomecânico de flexão, utilizando-se o Princípio de Arquimedes, foi verificado o volume ósseo como parâmetro físico do osso, para cálculo da densidade mineral óssea. A partir de pesagens com o osso imerso em água e livre (em balança eletrônica), chegou-se ao volume ósseo. O osso foi, entao, mantido na mufla a 800º para obtenção da cinza. O peso da cinza foi relacionado com o volume para obtenção da densidade mineral.26 A fórmula utilizada foi a seguinte: densidade mineral óssea = peso da cinza ÷ volume ósseo (g/mm3).
Após a obtenção dos resultados referentes à densidade mineral e ao teste de flexão do fêmur direito, esses dados foram relacionados entre si a fim de se verificar a qualidade óssea, expressa pela força máxima normalizada, descrita por SØgaard et al.27
Para a análise estatística dos resultados, foram utilizados o teste One-Way ANOVA para verificação de variância e o teste Tukey-Kramer para comparações entre grupos, considerando-se p<0,05.
RESULTADOS
Conforme apresentado na Tabela 1, verifica-se que houve diferenças significativas para carga máxima, entre os grupos ovx + sinv e int + sinv quando comparados cada qual ao grupo de ratas intactas. Também houve diferença significativa entre os grupos ovx + sinv e ovx + salina.
Não houve diferença significativa entre os grupos quanto à deformação do osso. Em relação à rigidez óssea, os grupos ovx + sinv e int + sinv apresentaram valores significativamente mais altos do que o grupo intactas. Não houve diferença significativa para esse parâmetro entre os grupos ovx + salina e ovx + sinv.
A Tabela 2 apresenta valores médios de ganho de massa corporal, densidade mineral óssea e força normalizada dos diferentes grupos.
Quanto ao ganho de massa corporal, o grupo de animais ovx + sinv apresentou valores significativamente mais altos do que os referentes ao grupo intactas e ao grupo de ratas ovx + sal. Houve diferença também entre o grupo int + sinv e intactas. Não houve diferenças entre os grupos no que se refere à densidade mineral óssea. Os grupos ovx + sinv e int + sinv apresentaram força máxima normalizada significativamente maior do que o grupo intactas. Não houve diferenças significativas para este parâmetro em relação ao grupo ovx + salina.
DISCUSSÃO
De acordo com os resultados, os animais submetidos à ovariectomia e que fizeram uso da sinvastatina apresentaram mais altos valores de carga máxima suportada no teste biomecânico de flexão de três pontos. Embora não significativo, o valor de densidade mineral também foi mais altos para os grupos que receberam sinvastatina, comparados aos grupos intactas e ao tratado com salina. Isso demontra que a sinvastatina apresentou efeitos positivos, prevenindo a diminuição de resistência óssea conseqüente à osteopenia provocada pela ovariectomia.
Os animais que fizeram uso da sinvastatina, ovariectomizados e intactos, apresentaram mais capacidade de resistir a uma carga, o que ficou demonstrado pela maior rigidez óssea, comparada à de outros grupos. O fato de não haver diferença para carga máxima e deformação, que determinam a rigidez, entre os grupos ovx + sinv e int + sinv, pode ser devido ao curto tempo de tratamento ou à baixa dose, não suficientes para promover alterações significativas. No entanto, apesar de também não haver diferença significativa para força máxima normalizada entre esses grupos, verifica-se que o grupo ovx + sinv apresenta valores mais altos desse parâmetro, o que indica boa relação entre a carga suportada e a densidade mineral óssea. Trata-se de um indicativo da qualidade do osso, conforme descrito por SØgaard et al.27.
Os resultados mostraram que a sinvastatina, medicação atualmente utilizada para a redução dos níveis de colesterol em humanos, apresenta possíveis efeitos protetores para a perda de massa óssea que ocorre em casos de osteopenia em ratas, como verificado aqui a partir da análise da resistência óssea, que reflete o conteúdo mineral ósseo.
Um outro estudo similar a este foi realizado por Oxlund e Andreassen28. Os autores trataram ratas de quatro meses de idade, ovariectomizadas, com 20 mg/kg de sinvastatina, duas vezes ao dia, durante três meses. Concluíram que a sinvastatina induziu moderado crescimento do osso cortical de estrutura lamelar normal e da superfície perios-tal, respeitando os limites regionais de formação óssea, em análises de tíbia e vértebra. Embora os autores tenham utilizado técnicas morfológicas e bioquímicas para análise de formação óssea cortical e trabecular, as propriedades biomecânicas do fêmur pelo teste de flexão de três pontos não foram avaliadas. No presente estudo, os resultados obtidos foram com dosagem de 5 mg/kg. Em um período menor de tratamento (oito semanas), verificou-se que uma dose menor é suficiente para interferir na qualidade do osso. Provavelmente, esse mecanismo de adaptação do osso cortical, sugerido pelos autores anteriormente citados, tenha permitido mais resistência à carga máxima imposta durante o teste biomecânico de flexão.
Em um outro trabalho,29 os autores perceberam que a sinvastatina promoveu osteogênese ao redor de implantes (fixadores) de titânio. Ela potencializou e melhorou a integração óssea natural, aumentando os valores da relação de contato ósseo e a densidade do osso.
No entanto, um estudo realizado por Yao et al.30 mostrou que a sinvastatina não apresentou resultados positivos, protetores para o osso, em ratas cuja perda de massa óssea ultrapassava 60 dias de duração. No presente estudo, o tratamento ocorreu durante o processo de perda de massa óssea, que se verifica após a ovariectomia. Portanto, a ação seria no sentido de prevenção da perda, antes que já houvesse ocorrida a espoliação.
Staal et al.31 verificaram, in vitro, que as estatinas inibem a reabsorção óssea, apesar de não encontrarem o mesmo resultado para cerivastatina em ratos. Pytlik et al.32 mostraram que a sinvastatina administrada nas doses de 3 e 6 mg duas vezes ao dia em ratas ovariectomizadas intensificou a formação óssea e diminuiu o processo de reposição óssea induzida pela ovariectomia com maior atividade no grupo que recebeu 6 mg/kg. Esta dosagem é próxima da utilizada no presente estudo, em que se procurou padronizar dose menor a partir dos dados da literatura.
Previamente, van Staa et al.33 descreveram que a dosagem dessa medicação, usada comumente na prática clínica para controle de hipertensão arterial, não está associada à redução dos riscos de fraturas. Um outro estudo não observou, em mulheres, efeitos da sinvastatina sobre marcadores de formação ou reabsorção óssea, durante tratamento de 12 semanas de duração.34
Ainda não está esclarecido o mecanismo de ação da estatina sobre o tecido ósseo. Maeda et al.35 sugeriram que a estatina estimula a expressão gênica em osteoblastos. Os resultados aqui encontrados, que refletem maior resistência óssea à carga de fratura, geram a questao: a estatina teria o mesmo efeito positivo quando o processo de reabsorção óssea já está instalado?
Outro dado relevante foi o aumento de massa corporal nos animais que receberam sinvastatina. Yao et al.30 verificaram aumento desse parâmetro em ratas ovariectomizadas tratadas com sinvastatina, nas doses variando entre 0,3 e 10,0 mg/kg, comparadas com ratas que receberam veículo. Pode ser que a dose de sinvastatina administrada não tenha apresentado efeito suficiente para a depuração de LDL, conforme indicado por Schulz36. O aumento de peso pode ter refletido em sobrecarga na matriz óssea e contribuído para o aumento de massa óssea, mineral e orgânica, tornando-a mais resistente à fratura. Possivelmente, também haveria efeito indireto do peso corporal no aumento da resistência óssea ou prevenção de sua diminuição.
CONCLUSÕES
Este estudo demonstra o efeito da sinvastatina sobre parâmetros biomecânicos do tecido ósseo de ratas ovariectomizadas, enfatizando a avaliação da resistência óssea a partir do teste de flexão de três pontos. O efeito protetor encontrado é indicativo de que o fármaco tem atuação, direta ou indireta, sobre o tecido ósseo, aumentando sua resistência às cargas impostas. Mais estudos devem ser realizados para verificação do mecanismo de ação das estatinas sobre o tecido ósseo.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo PAPE/UNIUBE - processo 2004-014
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